Acta Neuropathologica︱前沿！脑脊液tau蛋白新片段与AD中缠结病理和认知功能下降的关联性

Authorship (Chinese)︱LTNeurosci

Responding Editor︱LTNeurosci

Fig. 1 Overview of standard (a) and novel (b, c) immunoassays for t-tau and tau fragments: the traditional assay only detects the mid-region of tau;

novel immunoassays detect  fragments ending at amino acid 123 and amino acid 224 by Claudia Cicognola, et al.

阿尔茨海默症（AD）是最常见的神经退行性tau蛋白疾病，全球3560万痴呆病例中就有75%的人患有AD【1】。随着世界人口的老龄化，预计2030年患病率将翻一番【1】。目前，AD唯一的治疗选择是对症治疗，而疾病修饰治疗仍处于研发阶段【2】。

β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积和过磷酸化tau蛋白神经原纤维缠结是AD的典型病理特征【2】。脑脊液（CSF）中，这些病理变化体现为：低水平的Aβ42、低比率的Aβ42/Aβ40、高水平的磷酸化tau（p-tau）、以及高水平的总tau（t-tau)【3】。

tau蛋白病理，即tau蛋白的聚集和缠结的形成，是AD和原发性tau蛋白疾病的共同机制，如皮质基底神经变性（corticobasal neurodegeneration，CBD）和进展性核上麻痹（supranuclear palsy，PSP）。

尽管，在原发性tau蛋白疾病中，tau蛋白病理是以丝状或是以更加弥散的形式呈现于神经胶质细胞中，但是，tau蛋白病理主要存在于AD神经元中。

原发性tau蛋白疾病的临床表现非常不同。AD表现为记忆障碍，PSP表现为帕金森症（PD）；CBD临床表现则非常多样化，从PD症状到类AD症状，这些症状被称为皮质基底节综合征（corticobasal syndrome，CBS）【4】。

应用AD生物标志物可以更好地来鉴别AD类皮质基底节综合征（AD-like CBS），提供多样化治疗选择【5】。然而，几项关于原发性tau蛋白疾病CSF的研究则表明，t-tau和p-tau的浓度表现正常或较低，与AD中两者浓度上升形成鲜明对比，而且，目前还没有特异原发性tau蛋白疾病的CSF表达谱【5-7】。

尽管从方法论的角度来看，大多数的CSF t-tau数据源于组合型单克隆抗体（AT120, HT7和BT2）（其抗原表位位于蛋白质中间区域）的免疫测定（Fig. 1a），然而一些研究表明，tau蛋白是以不同的碎片形式存在于在大脑提取物和CSF中【8-11】。

Meredith JE Jr 等人利用高效液相色谱（HPLC）分离出了CSF蛋白，并通过Western Blotting将tau抗体与不同tau结构域进行了结合，结果发现CSF tau蛋白由一系列片段组成，其中tau蛋白N端和中区为CSF中最为丰富的变异【10】。另外，质谱（MS）也被证明有助于详细表征tau蛋白片段。

然而，CSF是一种很复杂的基质，需要对其进行多种预处理，达到足够的灵敏度后，才能用于检测其中的tau蛋白及其突变体【8-9,11】。

有研究组虽已在CSF中检测到了tau肽（从蛋白N端到蛋白C端）【8-9,11】，但是，AD中C端截断tau蛋白浓度上升是目前为止最具可重复性的结果，这与常规t-tau和p-tau免疫检测所产生的高度可重复性结果非常吻合【3】；同时，令人意外地是，包括原发性tau蛋白疾病在内其他神经退行性痴呆中，该tau蛋白浓度的十分正常【8-9】。

在体内模型中，通过对人中枢神经系统（CNS）和iPSC诱导神经元中进行稳定同位素（stable-isotope）标记，可以对AD特异性CSF tau蛋白表达谱做出可能性的解释【12】。结果表明，在CSF中和细胞介质中，大部分tau蛋白缺乏微管结合区域和C端部分；这些tau蛋白释放自神经元，而且Aβ的暴露可以激活这种tau蛋白的释放【12】。

目前，经有效评价获得的CSF tau蛋白浓度虽不能特异性表征缠结病理或神经退化，但却能反映出神经元Aβ病理反应。因此，鉴定出新的tau蛋白片段，对其分布和功能均进行建模，揭示其在AD发病机理中的具体作用，将有助于我们更好地理解AD型神经变性。

来自（瑞典）哥德堡大学Sahlgrenska 卡学院、（瑞典）Sahlgrenska大学医院、（美国）宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院、以及（瑞典）瑞典隆德大学等14家课题组的研究人员通过N-末端和中间区域特异性抗体富集tau蛋白，同时应用自底向上和自顶向下两种方法进行MS分析，成功揭示出脑脊液中tau蛋白新片段与AD缠结病理和认知功能下降的存在密切关联【13】。

该项前沿性成果于2018年12月13日以Novel tau fragments in cerebrospinal fluid: relation to tangle pathology and cognitive decline in Alzheimer’s disease为题发表在Acta Neuropathologica（IF=15.872）上【13】。

首先，Claudia Cicognola（文章一作和通讯作者，博士生）等人从CSF中免疫沉淀了tau蛋白，并利用高分辨MS鉴定出了两种不同类型的tau蛋白片段：Tau123 （starting at the N-terminal and ending at amino acid 123 through 129）和Tau224（tarting at mid-region pool covering amino acid 144-224（tau 441 numbering））(Fig. 2-3)。同时，研究者们培育了针对这两类tau蛋白碎片的具有新抗原表位（neo-epitope）的特异性抗体(Fig. 1b, c)。

Fig. 2 Top: endogenous tau species found with N-terminal and mid-region-specific antibodies (Tau 12 in red, HT7 in blue, BT2 in orange) and neo-epitope-specific antibodies (Tau_C123 in lime, Tau_C224 in green) with selected amino acid positions indicated. Alignment and numbering refer to the 2N isoform; for peptides originating from the 0N and 1N isoforms, 2N sequence portions not included are dimmed. The protein schematic structure shows the respective antibody epitopes and T181. 

Bottom: in black, range (Ac-2-254) of tryptic peptides detected in CSF with Tau12 (regions with no coverage are dimmed). Vertical lines indicate possible tryptic cleavage sites.

紧接着，Claudia Cicognola等人利用这些特异性抗体对脑组织进行免疫组化，并对三种tau蛋白N-123、N-224、x-224 进行了免疫测定(Fig. 2)。

Fig. 3  Representation of quantitative MS data of tau fragments immunoprecipitated with Tau 12, HT7, and BT2.

免疫测定的三类样本：可溶性大脑组分源于病理已确认的个体：AD患者81人、健康对照组33人；CSF样本来自于三个横向列队（cohorts）和两个纵向队列：AD患者133人、轻度认知功能障碍（MCI）38人、MCI-AD 20人、PSP患者31人、CBS患者15人、以及对照组91人；神经和周围来源的细胞外泡（NDEVs和PDEVs）样本：AD患者4人、对照组4人。

Fig. 4 Tau immunohistochemistry in Alzheimer’s disease (a and b; d and e; g and h) and a neurologically normal control (c, f, and i). 

Fig. 5 Brain levels (normalized for total protein content) of N-123 (a), N-224 (b) fragments,and t-tau (c) in AD  and controls and in AD over Braak stages III–VI (d, e, f) (lines representing the median, bars representing interquartile range)

实验发现，抗tau224蛋白抗体可以染色神经纤维缠结和神经纤维网线（neuropil threads），而抗tau123蛋白抗体在AD中仅表现为较弱的胞质染色(Fig. 4-5)。

进一步数据表明，在AD可溶性脑组织中，N-224 tau蛋白水平量低于对照组，而N-123 tau蛋白水平则与对照组相似；AD中的N-224 tau蛋白水平高于对照组CSF队列中的N-224 tau蛋白水平（p < 0.001），而N-123 tau蛋白水平则低于对照组（p < 0.001）(Fig. 6)。

Fig. 6 Validation cohort. Left column: concentration range of N-123 (a), N-224 (b), and x-224 (c) fragments in AD and controls (lines representing median; bars representing interquartile range; in a, bars removed due to the LOG scale). Right column: correlation of N-123 (d), N-224 (e), and x-224 (f) fragment to t-tau and linear regression in AD and controls.

此外，认知能力的下降和从MCI到AD的转换都与基线CSF N-224 tau蛋白水平的升高密切相关（p < 0.0001）(Fig. 7)；PSP和CBS中的N-224 tau蛋白浓度明显低于AD中的N-224 tau蛋白浓度（p < 0.0001），而且并未与t-tau和p-tau呈现出相关性(Fig. 8)。

Fig. 7 Longitudinal cohort. a, b Concentration range of N-123 (a) and N-224 (b) fragments in AD, MCI, and MCI-AD and OND (lines representing the median, bars representing interquartile range). c, d Disease progression over time in AD, MCI-AD and MCI cohorts, as measured by change in MMSE scores. Higher levels of CSF N-123 (a) and N-224 (b) tau at baseline are related to faster decline.

Fig. 8  PSP and CBS cohort. a, d Concentration of N-224 tau in PSP and CBS (a: Aβ+ and Aβ; d: Aβ−only) compared to AD and controls from the validation cohort (lines representing the median, bars representing interquartile range). b, c, e, f Correlation to t-tau (b) and p-tau (c) and linear regression in PSP and CBS cohorts (b, c: Aβ+ and Aβ; e, f: Aβ−only)

最后，研究者们发现，在一纵向队列中，CSF N-224 tau蛋白水平稳定程度超过6个月；对其进行AChE（乙酰胆碱酯酶）抑制剂处理时无显著效果；N-224 tau蛋白存在于NDEVs中，而N-123 tau蛋白在NDEVs和PDEVs中却有着相似的浓度(Fig. 9)。

Fig. 9  Scatter dot plots of N-123 (a) and N-224 tau (b) concentrations in serum extracellular vesicles (EVs) lysates, divided in AD and control NDEV and PDEV samples (lines representing median)

总的来说，Claudia Cicognola等人成功揭示出：CNS和PNS中均能产生N-123 tau蛋白，属于tau蛋白代谢的生物标记物；然而，N-224 tau蛋白具有神经元特异性，存在于缠结中，分泌自CSF，AD中N-224 tau蛋白水平会上调。整个研究表明：tau蛋白的裂解、传播与缠结病理和认知功能下降之间存在密切联系；为进一步理解AD和其他tau蛋白疾病的tau差异性提供了重要依据。

补充阅读

文献参考

【1】World Health Organization and Alzheimer’s Disease International (2012) Dementia: a public health priority. ISBN: 978 92 4156445 8.

【2】Scheltens P, et al (2016) Alzheimer’s disease.Lancet (Lond Engl) 388:505–517.

【3】Olsson B, et al (2016) CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer’s disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol 15:673–684.

【4】Armstrong MJ, et al (2013) Criteria for the diagnosis of corticobasal degeneration. Neurology 80:496–503.

【5】Borroni B, et al (2011) CSF Alzheimer’s disease-like pattern in corticobasal syndrome: evidence for a distinct disorder. J Neurol Neurosurg Psychiatry 82:834–838.

【6】Hall S, et al (2012) Accuracy of a panel of 5 cerebrospinal fluid biomarkers in the differential diagnosis of patients with dementia and/or parkinsonian disorders. Arch Neurol 69:1445–1452.

【7】Wagshal D, et al (2015) Divergent CSF tau alterations in two common tauopathies: Alzheimer’s disease and progressive supranuclear palsy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 86:244–250.

【8】Barthelemy NR, et al (2016) Tau protein quantification in human cerebrospinal fluid by targeted mass spectrometry at high sequence coverage provides insights into its primary structure heterogeneity. J Proteome Res 15:667–676.

【9】Barthelemy NR, et al (2016) Differential mass spectrometry profiles of tau protein in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer’s disease, progressive supranuclear palsy, and dementia with lewy bodies. J Alzheimer’s Dis 51:1033–1043.

【10】Meredith JE Jr, et al (2013) Characterization of novel CSF Tau and ptau biomarkers for Alzheimer’s disease. PLoS One 8:e76523.

【11】Russell CL, et al (2017) Comprehensive quantitative profiling of tau and phosphorylated tau peptides in cerebrospinal fluid by mass spectrometry provides new biomarker candidates. J Alzheimer’s Dis 55:303–313.

【12】Sato C, et al (2018) Tau kinetics in neurons andthe human central nervous system. Neuron 97(1284–1298):e1287.

【13】Claudia Cicognola, et al. Novel tau fragments in cerebrospinal fluid: relation to tangle pathology and cognitive decline in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica (2018) . https://doi.org/10.1007/s00401-018-1948-2.

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